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Strumenti del Dipartimento


Banner Strumenti | Dipartimento di Oncologia

Di seguito le informazioni relative agli strumenti di ricerca in dotazione del Dipartimento di Oncologia.


Citofluorimetria

Cell Sorter | Dipartimento di Oncologia

Descrizione

Il FACSMelody della BD è un sorter di cellule ad alta velocità a 9 colori altamente automatizzato. Si tratta di un sorter a 4 vie, dotato di 3 laser (405nm, 488nm e 561nm), un allineamento ottico fisso, un sistema fluidico a pressione e un noozle fisso da 100um, ideale per sortare la maggior parte dei tipi di tessuto. Il FACSMelody riduce al minimo i passaggi manuali e semplifica il flusso di lavoro grazie all’alto grado di automazione. È dotato di una versatile camera di raccolta che consente agli utenti di dividere le cellule in 4 vie diverse, quindi fino a 4 tubi diversi, o in piastre multipozzetto (piastre a 6, 24, 48, 96 e 384 pozzetti con una deposizione a cella singola o multipla controllata dal software) o vetrino da microscopio (griglia 3 x 9). Il raffreddamento e il riscaldamento per la raccolta dello smistamento sono volendo disponibili e regolabili tramite software: 4°C, 22°C, 37°C e 42°C. L’agitazione del campione è regolabile tramite il software per mantenere il campione costantemente sospeso. Lo strumento possiede alta sensibilità e capacità di risoluzione per rilevare e sortare cellule con debole segnale di fluorescenza, cellule rare e risolvere popolazioni adiacenti come cellule con bassa densità di antigene, piccole particelle e cicli cellulari basati sulla fase della replicazione del DNA. Inoltre, il software, denominato BD FACSChorus™, guida l'operatore attraverso l'intero processo di sorting delle cellule con la sua interfaccia intuitiva, istruzioni e suggerimenti sullo schermo e report di semplice lettura.

The BD FACSMelody is a highly automized, 9 colour high speed cell sorter. It is a 4-way cell sorter, equipped with 3 lasers (405nm, 488nm and 561nm), a fixed optical alignment, a pressure-driven fluidics system and a fixed 100um nozzle, ideal to sort most types of tissue.
The BD FACSMelody minimizes manual steps and simplifies the workflow with smart automation. It is equipped with a versatile sort collection chamber that allows users to sort into up to 4-way tubes or multiwells (plates: 6-, 24-, 48-, 96- and 384-well plates software controlled single or multiple cell deposition, one-way sorting) or microscope slide (3 x 9 grid). Cooling and heating for sort collection are available and adjustable through software: 4°C, 22°C, 37°C and 42°C. Sample agitation is adjustable through the software to keep the sample constantly suspended. High sensitivity and resolution to detect and sort dim cells and rare cells and resolve adjacent populations such as low-antigen density cells, small particles and DNA cell cycles
Moreover, the software, named BD FACSChorus™, guides the operator through the entire cell sorting process with its intuitive interface, on-screen instructions and tips and simple-to-read reports.

Citofluorimetro.png

Descrizione

Il citofluorimetro a flusso FACSCelesta della BD offre molteplici configurazioni per soddisfare le diverse esigenze applicative. La configurazione BVR include I laser blu, viola e rosso, ottimizzati per ottenere il massimo dai fluorocromi comuni più noti, dai coloranti di vitalità e dai nuovi fluorocromi BD Horizon Brilliant™. Il laser blu è ormai uno standard nella citometria a flusso, il laser viola sta guadagnando popolarità man mano che vengono introdotti e adottati fluorocromi più luminosi che vengono eccitati dal laser viola. Il laser rosso, che eccita in modo ottimale l'alloficocianina (APC) e i coloranti tandem a base di APC, consente di distribuire i marcatori su più laser, riducendo ulteriormente la compensazione complessiva necessaria per un pannello multicolore. La progettazione del pannello di citometria a flusso multicolore ha presentato finora sfide per i ricercatori, come la variazione dell'espressione dei marcatori, la variazione della brillantezza del colorante e un significativo spillover di emissione tra i canali di fluorescenza. La combinazione dell’uso di fluorocromi brillanti a spettro ristretto e di un sistema ottico molto sensibile si traduce nell’applicazione di pannelli in grado di risolvere facilmente anche popolazioni poco rappresentate, inoltre sono facili da usare e compensare. Il sistema funziona con il software BD FACSDiva™, che offre un insieme di strumenti pratici e di semplice utilizzo per la configurazione del citofluorimetro, del protocollo di acquisizione, per l'acquisizione l'analisi dei dati.

The BD FACSCelesta flow cytometer offers multiple configurations to meet varied application needs. The BVR configuration includes Blue, Violet, and Red lasers, optimized to get the most out of the legacy fluorochromes, viability dyes, and BD Horizon Brilliant™ dyes. While a blue laser has long been standard in flow cytometry, the violet laser is gaining popularity as more bright violet-excited fluorochromes are introduced and adopted. The red laser, which optimally excites allophycocyanin (APC) and APC-based tandem dyes, allows markers to be spread across more lasers, further reducing the overall compensation needed for a multicolor panel. Multicolor flow cytometry panel design has presented challenges for researchers, such as varying marker expression, varying dye brightness, and significant emission spillover between fluorescence channels. The combination of new bright, narrow-spectrum fluorochromes and sensitive optics results in panels that can readily resolve even dim populations, yet are easy to use and compensate. The system operates with BD FACSDiva™ software, a collection of convenient and easy-to-use tools for flow cytometer and application setup, data acquisition, and data analysis.

PCR

DIGITAL PCR 1

Digital_PCR_1-mod.png

Descrizione

La digital PCR consente la quantificazione assoluta di un target (DNA o RNA) con massima precisione e sensibilità. Con la tecnologia a disposizione, il campione da analizzare viene automaticamente distribuito sulla superficie di un chip dedicato, dove avviene la sua compartimentalizzazione in 20.000 micropozzetti, ognuno virtualmente occupato da una singola molecola. Minimizzando in questo modo gli effetti negativi determinati dalla competizione tra target, soprattutto nel caso di sequenze rare, la dPCR consente di amplificare e quantificare minime tracce di acidi nucleici con una chimica analoga a quella della real-time tradizionale, basata su sonde fluorescenti (FAM e VIC). La piattaforma QuantStudio 3D Digital PCR System comprende tre strumenti, ovvero (1) un QuantStudio 3D Digital PCR Chip Loader per la dispensazione del campione nel chip, (2) un termociclatore ProFlex 2x Flat PCR System per l’amplificazione simultanea di massimo 24 chip, (3) un QuantStudio 3D Digital PCR Instrument per l’acquisizione dei chip stessi. La digital PCR si presta a molteplici applicazioni, tra cui la biopsia liquida, l’analisi di copy number variation e di espressione genica, la discriminazione allelica, la ricerca di sequenze rare, le analisi single-cell.

Digital PCR allows an absolute quantification of a DNA or RNA target with superior accuracy and sensitivity. Using this technology, the analytical sample is automatically distributed on the surface of a dedicated chip, where it is compartmentalized into 20.000 microwells, each virtually occupied by a single molecule. By minimizing the negative effects due to competition among targets, especially in the case of rare sequences, minute amounts of nucleic acids can be amplified and quantified by TaqMan chemistry with fluorescent probes (FAM, VIC), similarly to traditional qPCR. The QuantStudio 3D Digital PCR System platform includes three instruments: (1) a QuantStudio 3D Digital PCR Chip Loader for sample dispensation on the chip, (2) a ProFlex 2x Flat PCR System thermal cycler for the simultaneous amplification of up to 24 chips, (3) a QuantStudio 3D Digital PCR Instrument for data acquisition from chips. Digital PCR can be applied to liquid biopsy, for copy number variation and gene expression analysis, allelic discrimination, rare sequence mining and single-cell analysis.


DIGITAL PCR 2

Digital PCR 2 | Dipartimento di Oncologia

Descrizione

QuantStudio Absolute Q è una piattaforma di digital PCR basata su tecnologia microfluidica su piastra, che consente l’utilizzo di un unico strumento per gli step di compartimentalizzazione del campione, amplificazione del segnale e acquisizione dei dati. L’intero processo, analogo a quello di una comune qPCR, ha una durata di circa 90 minuti. Appositi canali di distribuzione consentono il riempimento simultaneo di 20.480 microcamere con estrema sensibilità, precisione e accuratezza, garantendo l’analisi di oltre il 95% del campione caricato. Ogni piastra può contenere da 4 a 16 campioni, interrogando fino a 4 fluorescenze in contemporanea (FAM, VIC, ABY, CY5) e dunque permettendo analisi in multiplex. Come ogni strumento di dPCR, il macchinario fornisce una conta assoluta del target specifico, misurata come numero di copie/microlitro di reazione. Al di là di una Master Mix dedicata, lo strumento può impiegare comuni sonde TaqMan (con possibilità di adattare anche primer in SYBR-GREEN). La digital PCR si presta a molteplici applicazioni, tra cui la biopsia liquida, l’analisi di copy number variation e di espressione genica, la discriminazione allelica, la ricerca di sequenze rare, le analisi single-cell.

QuantStudio Absolute Q is a digital PCR platform based on a microfluidic array plate technology that enables all the necessary steps for dPCR—compartmentalizing, thermal cycling, and data acquisition—to be conducted on a single instrument. The whole process, similar to a traditional qPCR, lasts approximately 90 minutes. Dedicated distribution channels allow the simultaneous filling of 20.480 microchambers with high sensitivity, precision and accuracy and assuring the analysis of more than 95% of the loaded sample. Each plate can contain from 4 to 16 samples, interrogating up to 4 fluorescent dyes at the same time (FAM, VIC, ABY, CY5), thus enabling multiplex analyses. Like any other dPCR machine, the instrument gives an absolute count of the specific target(s), measured as copies/microliter of reaction. Beside of a dedicated Master Mix, the instrument works with traditional TaqMan probes (with the option to use SYBR-GREEN as well). Digital PCR is suitable for multiple applications, including liquid biopsy, copy number variation and gene expression analysis, allelic discrimination, rare sequence mining and single-cell analysis.

REAL TIME PCR 1

Real_Time_PCR_1_aq.png

Descrizione

ABI PRISM® 7900HT è uno strumento di seconda generazione progettato per il rilevamento automatizzato e ad alta efficienza di sostanze chimiche fluorescenti. Dotato di un blocco campione da 384 pozzetti, lo strumento è in grado di eseguire l'analisi di Real Time PCR, end-point e della curva di dissociazione. Con questo strumento è possibile scegliere tra l'utilizzo di una sonda TaqMan® per il rilevamento di una singola sequenza di acido nucleico target o del SYBR® Green Double-Stranded DNA Binding Dye 1 utilizzato per il rilevamento di molecole di DNA a doppio filamento.
Il sistema ABI PRISM 7900HT rileva i segnali fluorescenti generati da diversi coloranti come FAM™, NED™, ROX™, SYBR®, TAMRA™, TET™ e VIC™. In seguito il software SDS esegue una serie di calcoli matematici sui dati grezzi che si ottengono dalla rilevazione di emissioni fluorescenti comprese tra i 500 nm e 660 nm rilevando anche il colorante inerte ROX™ utilizzato in questo caso come fattore di normalizzazione per le emissioni fluorescenti rilevate nei campioni.

The ABI PRISM® 7900HT Sequence Detection System is a second-generation sequence detection system instrument designed for automated, high-throughput detection of fluorescent PCR-related chemistries. Carrying a 384-well sample block, the instrument is capable of real-time, end-point, and dissociation curve analysis of assays arrayed on multiple formats. With this instrument it is possible to chose between using a TaqMan® probe in a master mix for the detection of a single target nucleic acid sequence, or the SYBR® Green Double-Stranded DNA Binding Dye 1 used for the detection of double-stranded DNA.
The SDS software performs a series of mathematical transformations on the raw data which refers to the spectral data between 500 nm to 660 nm collected by the SDS software during the sequence detection run.
The ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System monitors fluorescent signals generated by several dyes FAM™, NED™, ROX™, SYBR®, TAMRA™, TET™, and VIC™. The Applied Biosystems buffer contains an internal passive reference molecule (ROX™), which acts as a normalization factor for fluorescent emissions detected in the samples. Multicomponenting is the term used for distinguishing the contribution each individual dye and background component makes to the fluorescent spectra detected by the 7900HT instrument. During the multicomponent transformation, the SDS software employs several algorithms to separate the composite spectra from the raw spectrum and then to determine the contribution of each dye in the raw data.


REAL TIME PCR 2

Real-Time PCR 2 | Dipartimento di Oncologia

Descrizione

Lo strumento CFX Opus Real-Time PCR è un sistema che fornisce un rilevamento ed una quantificazione altamente specifica di un determinato target di interesse. E’ dotato di un blocco campione integrato da 96 pozzetti e di un display touch screen che permette di interfacciassi facilmente con il macchinario.
Lo strumento dispone di 6 diversi filtri ed è in grado di rilevare lunghezze d'onda di emissione da 450 a 730 nm. I sistemi CFX Opus includono anche un canale dedicato alla chimica FRET e hanno la possibilità di eseguire un'analisi multiplex di 5 targets per pozzetto.
Permette la quantificazione della PCR con curva standard, analisi della curva di fusione, analisi dell'espressione genica per quantità relativa (∆Cq), discriminazione allelica e analisi End-point.
Nello strumento CFX Opus è possibile creare nuove cartelle di lavoro che permettono di accedere e gestire facilmente i files delle corse. Tramite diverse funzionalità è possibile scaricare, inviare e analizzare i dati ottenuti. Infatti CFX Opus è associato all’app BR.io di Bio-Rad che permette di gestire file PCR con la possibilità di creare esperimenti, scaricarli ed eseguirli sul sistema, quindi analizzare i risultati.
E’ anche possibile l'uso della rete wireless (WiFi) ed Ethernet che permette una volta connesso correttamente, la possibilità di inviare notifiche e-mail direttamente a un account utente specifico e accedere alla cartella di rete condivisa. Altra alternativa è l’utilizzo della porta USB per scaricare i dati ottenuti.

The CFX Opus Real-Time PCR is a real-time PCR system with an integrated 96-well sample block and a touch screen display, that provide sensitive detection for precise quantification and target discrimination, with the possibility to perform a multiplex analysis of 5 targets per well.
The instrument has 6 different filters and can detect emission wavelengths from 450 to 730 nm. CFX Opus systems also include a channel dedicated to FRET chemistry.
Can perform PCR quantification with standard curve, Melt curve analysis, gene expression analysis by relative quantity (∆Cq), Allelic discrimination and End-point analysis.
CFX Opus system’s file browser feature allows to create and manage stored data files that could be transferr by different options: Bio-Rad’s BR.io app allows to manage PCR file and data analysis with the possibility to create real-time PCR experiments in the app, download and run them on CFX Opus system, and then analyze the results.
Another option is the use of wireless network (WiFi), Ethernet, and USB, when successfully connected it is possible to send email notifications directly to a specified user account and access shared network folder.

CTC

CTC | Dipartimento di Oncologia

Descrizione

TellDx è un sistema per l’isolamento di cellule tumorali circolanti (CTC) da campioni di biopsia liquida. La piattaforma TellDx comprende essenzialmente il CTC Isolator II ed un CTC iChiP monouso. Il CTC Isolator II è uno strumento da banco che fornisce l’adeguato supporto biofisico, l’allineamento meccanico e il buffer per permettere il funzionamento del ChiP microfluidico stesso. All’interno di quest’ultimo, il campione di sangue, preincubato con biglie magnetiche coniugate ad anticorpi che riconoscono i globuli bianchi, viene dapprima sottoposto ad una separazione idrodinamica, che segrega e rimuove, per dimensione, globuli rossi e piastrine. Seguono una focalizzazione inerziale per generare un singolo fascio di cellule e l’applicazione di un campo magnetico, che allontana i globuli bianchi legati alle biglie e consente l’arricchimento e il recupero delle CTC, ancora vitali. Questa strategia di deplezione negativa è completamente agnostica rispetto all’espressione di marcatori specifici sulle CTC e garantisce dunque il mantenimento dell’intera popolazione in tutta la sua eterogeneità. Le CTC, una volta raccolte, possono essere opportunamente marcate ed enumerate, utilizzate per il monitoraggio della malattia minima residua, impiegate per caratterizzazioni molecolari e analisi single-cell, oppure messe in coltura per studi funzionali.

TellDx is a system for the isolation of circulating tumor cells (CTC) from liquid biopsy samples. The TellDx platform consists of the CTC Isolator II, which is used in conjunction with a disposable CTC iChip. The CTC Isolator II is a standalone, bench-top instrument intended to provide biophysical support, mechanical alignment, and fluidic supply to the microfluidic Chip. Within the Chip, the blood sample, preincubated with magnetic beads conjugated with antibodies recognizing white blood cells, is first subjected to hydrodynamic cell sorting for size-based separation of red blood cells and platelets. Then, inertial focusing generates a single central stream of cells and magnetopheresis deflects beads-tagged white blood cells, resulting in viable CTC enrichment and recovery. This negative depletion strategy is completely agnostic regarding expression of CTC-specific markers, this allowing preservation of the whole population and its heterogeneity. Once collected, CTC can be stained and enumerated, used for minimal residual disease monitoring, exploited for molecular characterization and single-cell analyses, or put in culture for functional studies.

NGS

NGS | Dipartimento di Oncologia

Descrizione

Il sequenziamento di nuova generazione (NGS), noto come "high throughput" o "sequenziamento massivo e parallelo", consente di determinare le sequenze nucleotidiche in regioni “target” e “de novo” degli acidi desossiribonucleici (DNA) e ribonucleici (RNA), in modo rapido ed economico rispetto a metodi ritenuti ortogonali come la tecnologia Sanger o il Pyro-Sequencing. Questo approccio ha avuto un grande impatto su diversi campi della ricerca molecolare, sia nell’ ambito delle scienze di base che di quelle applicate. Le tecnologie NGS sono in grado di studiare centinaia di geni simultaneamente in diversi campioni per ogni corsa di sequenziamento, analizzando varianti nucleotidiche singole o multiple (SNVs- MNVs), inserzioni e/o delezioni (INDEL), trascritti di RNA aberranti e varianti del numero di copie (CNV) con una performance del 99% in termini di accuratezza diagnostica e del 95-99% in termini di riproducibilità.
Gli strumenti NGS si sono rapidamente evoluti negli ultimi 15 anni e nuove piattaforme vengono continuamente commercializzate. Nel nostro laboratorio di ricerca traslazionale, le analisi NGS sono state implementate a partire dal 2019 con il sequenziatore Ion GeneStudio™ S5 Prime mediante l’utilizzo di pannelli ampi personalizzati o commerciali necessari per elaborare un approccio di sequenziamento “target” (Target-seq). GeneStudio S5 Prime appartiene ai sequenziatori prodotti da Thermo-Fisher, di cui sono disponibili diverse versioni, in particolare questa piattaforma supporta un'ampia gamma di sequenziamenti ad alta produttività principalmente finalizzata alla ricerca clinica. La tecnologia Ion Torrent™ traduce direttamente la sequenza di nucleotidi (A, C, G, T) in informazioni digitali su chip semiconduttore. La chimica protonica applicata alla tecnologia dei semiconduttori fornisce risultati di sequenziamento rapidi, accurati e scalabili. La tecnologia avanzata dello strumento consente di fornire dati di sequenziamento di alta qualità, anche per campioni complessi e difficili, come quelli ottenuti da preparazioni istologiche o citologiche da campioni fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE). La piattaforma di sequenziamento è dotata di software Torrent Suite™ 5.18 (MAN0026467 Rev. D.0) per l'analisi dei dati in tempo reale e dello Ion Chef™System (MAN0017275 Rev. D.0) per la preparazione automatizzata delle librerie genomiche e il caricamento dei chip

Next-generation sequencing (NGS), known as "high throughput" and/or "massively-parallel sequencing" allows to investigate a large number of applications, including targeted and de novo nucleotide sequence of deoxyribonucleic acids (DNA) and ribonucleic acids (RNA), quickly and cost-effectively compared with orthogonal methods such as Sanger or Pyro-Sequencing technology. This approach has had a great impact on several fields of molecular research for basic and applied science. The introduction of these technologies within international and national laboratories supported a great scientific innovation resulted from a “multi-target” study approach. NGS technology is able to investigated hundreds of genes simultaneously in several samples for each sequencing run, testing single or multiple nucleotide variants (SNVs/MNV), insertion and/ or deletion (INDEL), aberrant RNA transcripts and copy number variations (CNV) with 99% of limit of detection (LOD) performance, specificity, sensibility, accuracy, repeatability and 95-99% of reproducibility for each test. NGS technology has rapidly evolved over the past 15 years and new methods are continually being commercialized. In our translational research laboratory, NGS analysis, were performed since 2019 by Ion GeneStudio™ S5 Prime Sequencers with custom or commercial broad panel necessary to elaborate a targeted sequencing approach. GeneStudio S5 belongs to Thermo-Fisher brand and several versions of their platform are available, in particular this version supported a broad range of high-throughput sequencing for clinical research. Ion Torrent™ technology directly translates nucleotide sequence (A, C, G, T) into digital information on a semiconductor chip. A “proton chemistry” that applied to semiconductor technology provides fast, accurate and scalable sequencing results. The instrument's advanced technology enables it to provide high-quality sequencing data, even for complex and difficult samples such as samples obtained from histological or cytological preparations by samples formalin-fixed and paraffine-embedded (FFPE). This sequencer is equipped with Torrent Suite™ Software 5.18 (MAN0026467 Rev. D.0) for real-time data analysis and Ion Chef™ System (MAN0017275 Revision D.0) for automated genomic library preparation and chip loading


 

Ultimo aggiornamento: 14/11/2023 15:13
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