Dipartimento di Oncologia

Il FACSMelody della BD è un sorter di cellule ad alta velocità a 9 colori altamente automatizzato. Si tratta di un sorter a 4 vie, dotato di 3 laser (405nm, 488nm e 561nm), un allineamento ottico fisso, un sistema fluidico a pressione e un noozle fisso da 100um, ideale per sortare la maggior parte dei tipi di tessuto. Il FACSMelody riduce al minimo i passaggi manuali e semplifica il flusso di lavoro grazie all’alto grado di automazione. È dotato di una versatile camera di raccolta che consente agli utenti di dividere le cellule in 4 vie diverse, quindi fino a 4 tubi diversi, o in piastre multipozzetto (piastre a 6, 24, 48, 96 e 384 pozzetti con una deposizione a cella singola o multipla controllata dal software) o vetrino da microscopio (griglia 3 x 9). Il raffreddamento e il riscaldamento per la raccolta dello smistamento sono volendo disponibili e regolabili tramite software: 4°C, 22°C, 37°C e 42°C. L’agitazione del campione è regolabile tramite il software per mantenere il campione costantemente sospeso. Lo strumento possiede alta sensibilità e capacità di risoluzione per rilevare e sortare cellule con debole segnale di fluorescenza, cellule rare e risolvere popolazioni adiacenti come cellule con bassa densità di antigene, piccole particelle e cicli cellulari basati sulla fase della replicazione del DNA. Inoltre, il software, denominato BD FACSChorus™, guida l'operatore attraverso l'intero processo di sorting delle cellule con la sua interfaccia intuitiva, istruzioni e suggerimenti sullo schermo e report di semplice lettura.

Il citofluorimetro a flusso FACSCelesta della BD offre molteplici configurazioni per soddisfare le diverse esigenze applicative. La configurazione BVR include I laser blu, viola e rosso, ottimizzati per ottenere il massimo dai fluorocromi comuni più noti, dai coloranti di vitalità e dai nuovi fluorocromi BD Horizon Brilliant™. Il laser blu è ormai uno standard nella citometria a flusso, il laser viola sta guadagnando popolarità man mano che vengono introdotti e adottati fluorocromi più luminosi che vengono eccitati dal laser viola. Il laser rosso, che eccita in modo ottimale l'alloficocianina (APC) e i coloranti tandem a base di APC, consente di distribuire i marcatori su più laser, riducendo ulteriormente la compensazione complessiva necessaria per un pannello multicolore. La progettazione del pannello di citometria a flusso multicolore ha presentato finora sfide per i ricercatori, come la variazione dell'espressione dei marcatori, la variazione della brillantezza del colorante e un significativo spillover di emissione tra i canali di fluorescenza. La combinazione dell’uso di fluorocromi brillanti a spettro ristretto e di un sistema ottico molto sensibile si traduce nell’applicazione di pannelli in grado di risolvere facilmente anche popolazioni poco rappresentate, inoltre sono facili da usare e compensare. Il sistema funziona con il software BD FACSDiva™, che offre un insieme di strumenti pratici e di semplice utilizzo per la configurazione del citofluorimetro, del protocollo di acquisizione, per l'acquisizione l'analisi dei dati.

La digital PCR consente la quantificazione assoluta di un target (DNA o RNA) con massima precisione e sensibilità. Con la tecnologia a disposizione, il campione da analizzare viene automaticamente distribuito sulla superficie di un chip dedicato, dove avviene la sua compartimentalizzazione in 20.000 micropozzetti, ognuno virtualmente occupato da una singola molecola. Minimizzando in questo modo gli effetti negativi determinati dalla competizione tra target, soprattutto nel caso di sequenze rare, la dPCR consente di amplificare e quantificare minime tracce di acidi nucleici con una chimica analoga a quella della real-time tradizionale, basata su sonde fluorescenti (FAM e VIC). La piattaforma QuantStudio 3D Digital PCR System comprende tre strumenti, ovvero (1) un QuantStudio 3D Digital PCR Chip Loader per la dispensazione del campione nel chip, (2) un termociclatore ProFlex 2x Flat PCR System per l’amplificazione simultanea di massimo 24 chip, (3) un QuantStudio 3D Digital PCR Instrument per l’acquisizione dei chip stessi. La digital PCR si presta a molteplici applicazioni, tra cui la biopsia liquida, l’analisi di copy number variation e di espressione genica, la discriminazione allelica, la ricerca di sequenze rare, le analisi single-cell.

QuantStudio Absolute Q è una piattaforma di digital PCR basata su tecnologia microfluidica su piastra, che consente l’utilizzo di un unico strumento per gli step di compartimentalizzazione del campione, amplificazione del segnale e acquisizione dei dati. L’intero processo, analogo a quello di una comune qPCR, ha una durata di circa 90 minuti. Appositi canali di distribuzione consentono il riempimento simultaneo di 20.480 microcamere con estrema sensibilità, precisione e accuratezza, garantendo l’analisi di oltre il 95% del campione caricato. Ogni piastra può contenere da 4 a 16 campioni, interrogando fino a 4 fluorescenze in contemporanea (FAM, VIC, ABY, CY5) e dunque permettendo analisi in multiplex. Come ogni strumento di dPCR, il macchinario fornisce una conta assoluta del target specifico, misurata come numero di copie/microlitro di reazione. Al di là di una Master Mix dedicata, lo strumento può impiegare comuni sonde TaqMan (con possibilità di adattare anche primer in SYBR-GREEN). La digital PCR si presta a molteplici applicazioni, tra cui la biopsia liquida, l’analisi di copy number variation e di espressione genica, la discriminazione allelica, la ricerca di sequenze rare, le analisi single-cell.

ABI PRISM® 7900HT è uno strumento di seconda generazione progettato per il rilevamento automatizzato e ad alta efficienza di sostanze chimiche fluorescenti. Dotato di un blocco campione da 384 pozzetti, lo strumento è in grado di eseguire l'analisi di Real Time PCR, end-point e della curva di dissociazione. Con questo strumento è possibile scegliere tra l'utilizzo di una sonda TaqMan® per il rilevamento di una singola sequenza di acido nucleico target o del SYBR® Green Double-Stranded DNA Binding Dye 1 utilizzato per il rilevamento di molecole di DNA a doppio filamento.
Il sistema ABI PRISM 7900HT rileva i segnali fluorescenti generati da diversi coloranti come FAM™, NED™, ROX™, SYBR®, TAMRA™, TET™ e VIC™. In seguito il software SDS esegue una serie di calcoli matematici sui dati grezzi che si ottengono dalla rilevazione di emissioni fluorescenti comprese tra i 500 nm e 660 nm rilevando anche il colorante inerte ROX™ utilizzato in questo caso come fattore di normalizzazione per le emissioni fluorescenti rilevate nei campioni.

Lo strumento CFX Opus Real-Time PCR è un sistema che fornisce un rilevamento ed una quantificazione altamente specifica di un determinato target di interesse. E’ dotato di un blocco campione integrato da 96 pozzetti e di un display touch screen che permette di interfacciassi facilmente con il macchinario.
Lo strumento dispone di 6 diversi filtri ed è in grado di rilevare lunghezze d'onda di emissione da 450 a 730 nm. I sistemi CFX Opus includono anche un canale dedicato alla chimica FRET e hanno la possibilità di eseguire un'analisi multiplex di 5 targets per pozzetto.
Permette la quantificazione della PCR con curva standard, analisi della curva di fusione, analisi dell'espressione genica per quantità relativa (∆Cq), discriminazione allelica e analisi End-point.
Nello strumento CFX Opus è possibile creare nuove cartelle di lavoro che permettono di accedere e gestire facilmente i files delle corse. Tramite diverse funzionalità è possibile scaricare, inviare e analizzare i dati ottenuti. Infatti CFX Opus è associato all’app BR.io di Bio-Rad che permette di gestire file PCR con la possibilità di creare esperimenti, scaricarli ed eseguirli sul sistema, quindi analizzare i risultati.
E’ anche possibile l'uso della rete wireless (WiFi) ed Ethernet che permette una volta connesso correttamente, la possibilità di inviare notifiche e-mail direttamente a un account utente specifico e accedere alla cartella di rete condivisa. Altra alternativa è l’utilizzo della porta USB per scaricare i dati ottenuti.

TellDx è un sistema per l’isolamento di cellule tumorali circolanti (CTC) da campioni di biopsia liquida. La piattaforma TellDx comprende essenzialmente il CTC Isolator II ed un CTC iChiP monouso. Il CTC Isolator II è uno strumento da banco che fornisce l’adeguato supporto biofisico, l’allineamento meccanico e il buffer per permettere il funzionamento del ChiP microfluidico stesso. All’interno di quest’ultimo, il campione di sangue, preincubato con biglie magnetiche coniugate ad anticorpi che riconoscono i globuli bianchi, viene dapprima sottoposto ad una separazione idrodinamica, che segrega e rimuove, per dimensione, globuli rossi e piastrine. Seguono una focalizzazione inerziale per generare un singolo fascio di cellule e l’applicazione di un campo magnetico, che allontana i globuli bianchi legati alle biglie e consente l’arricchimento e il recupero delle CTC, ancora vitali. Questa strategia di deplezione negativa è completamente agnostica rispetto all’espressione di marcatori specifici sulle CTC e garantisce dunque il mantenimento dell’intera popolazione in tutta la sua eterogeneità. Le CTC, una volta raccolte, possono essere opportunamente marcate ed enumerate, utilizzate per il monitoraggio della malattia minima residua, impiegate per caratterizzazioni molecolari e analisi single-cell, oppure messe in coltura per studi funzionali.

Il sequenziamento di nuova generazione (NGS), noto come "high throughput" o "sequenziamento massivo e parallelo", consente di determinare le sequenze nucleotidiche in regioni “target” e “de novo” degli acidi desossiribonucleici (DNA) e ribonucleici (RNA), in modo rapido ed economico rispetto a metodi ritenuti ortogonali come la tecnologia Sanger o il Pyro-Sequencing. Questo approccio ha avuto un grande impatto su diversi campi della ricerca molecolare, sia nell’ ambito delle scienze di base che di quelle applicate. Le tecnologie NGS sono in grado di studiare centinaia di geni simultaneamente in diversi campioni per ogni corsa di sequenziamento, analizzando varianti nucleotidiche singole o multiple (SNVs- MNVs), inserzioni e/o delezioni (INDEL), trascritti di RNA aberranti e varianti del numero di copie (CNV) con una performance del 99% in termini di accuratezza diagnostica e del 95-99% in termini di riproducibilità.
Gli strumenti NGS si sono rapidamente evoluti negli ultimi 15 anni e nuove piattaforme vengono continuamente commercializzate. Nel nostro laboratorio di ricerca traslazionale, le analisi NGS sono state implementate a partire dal 2019 con il sequenziatore Ion GeneStudio™ S5 Prime mediante l’utilizzo di pannelli ampi personalizzati o commerciali necessari per elaborare un approccio di sequenziamento “target” (Target-seq). GeneStudio S5 Prime appartiene ai sequenziatori prodotti da Thermo-Fisher, di cui sono disponibili diverse versioni, in particolare questa piattaforma supporta un'ampia gamma di sequenziamenti ad alta produttività principalmente finalizzata alla ricerca clinica. La tecnologia Ion Torrent™ traduce direttamente la sequenza di nucleotidi (A, C, G, T) in informazioni digitali su chip semiconduttore. La chimica protonica applicata alla tecnologia dei semiconduttori fornisce risultati di sequenziamento rapidi, accurati e scalabili. La tecnologia avanzata dello strumento consente di fornire dati di sequenziamento di alta qualità, anche per campioni complessi e difficili, come quelli ottenuti da preparazioni istologiche o citologiche da campioni fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE). La piattaforma di sequenziamento è dotata di software Torrent Suite™ 5.18 (MAN0026467 Rev. D.0) per l'analisi dei dati in tempo reale e dello Ion Chef™System (MAN0017275 Rev. D.0) per la preparazione automatizzata delle librerie genomiche e il caricamento dei chip